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大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3及LST细胞的研究

时间:2005-10-27南方医院消化内科  作者:肖冰、宋卫兵查看次数:4622

大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3LST细胞的研究

肖冰  宋卫兵

    大肠癌是一种涉及许多相关基因的多因素多阶段的恶性肿瘤,实验表明染色体外存在抑癌因素,维持细胞的肿瘤特性需要线粒体DNAmitochondria DNAmtDNA)的参与。大肠肿瘤的mtDNA改变,国内外少有文献报告,且意见不一,不尽相同。Savre-Train等在结肠癌细胞系Caco-2中检测到2583bp大片段的缺失,缺失为1%,而未检测到碱基突变及线粒体基因组不稳定。Heerdt等研究中,在结肠癌细胞mtDNAD-loop区存在基因组的多态性,而未发现有mtDNA的突变及mtGI(genetic instability)。而Habano在对45对结肠癌和正常组织的mtDNA的研究中,发现有7/4516%)存在突变,包括3例编码ND1ND5的移码突变,2例错义突变,15Kbp的缺失,而没有大片段的缺失,并且进一步研究发现其中22mtDNA D-loop区存在(CA)n 不稳定及多聚C不稳定。这些研究阐明了在大肠癌细胞中存在mtDNA的改变,但未涉及到mtDNA在大肠癌发生和演变中的作用机制,也未涉及到mtDNA与大肠癌发生有关的癌基因和抑癌基因的内在关系。人类的线粒体基因组是环状、双链DNA,由于mtDNA全长也仅仅16 Kb多,而且序列早已完全清楚,只要通过设计适当的引物分别进行PCR和测序即可获得该细胞mtDNA的序列,因此为研究提供了方便。mtDNA分编码区和非编码区,即D-环区。D-环区包括重链的复制起点等重要序列,成为研究热点。本课题组通过PCR及测序等技术分析了人大肠癌细胞株中细胞线粒体DNA变异,包括突变、缺失、DNA不稳定性等,发现通过SW480,LoVoHT29细胞株的mtDNA D-环区基因序列测序,检测出分别有1098位突变点。而且检测到不同癌细胞株中检测到相同的突变位点,如LoVo细胞与SW480细胞均有16224位,TC,16311位,TCSW480 细胞与HT29细胞均有114位,CT498位,CT16234位,CT。因此,为了进一步研究mtDNA突变与肿瘤发生发展的内在联系,我们将大肠癌细胞突变的mtDNA转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)及人大肠侧向发育性肿瘤细胞(晚霜排行榜护手ab fat loss效果好的左旋肉碱哪个好面膜怎样瘦腿最快最有效补水面膜排行榜日霜什么眼霜好丰胸去黑头最有效的产品眼线治疗脚气最好的药排名睡眠面膜哪个好瘦脸面膜什么牌子好LST),观察转染细胞的线粒体DNA改变的特点和mtDNA片段在转染细胞核内的整合情况,并进一步观察转染细胞生物学行为的改变。旨在初步探讨mtDNA突变在大肠癌发生中的作用。

实验方法:

    1.克隆突变的大肠癌线粒体DNAmtDNA)基因,构建pcDNA3. I(+)-mtDNA重组真核表达载体。

    2.通过脂质体法(lipofectamine 2000 ),将大肠癌细胞突变的mtDNA真核表达载体转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)及人大肠侧向发育性肿瘤细胞(LST),利用G418抗性筛选转染细胞。

    3. 通过PCR技术验证mtDNA片段在转染细胞核内的整合情况;通过PCR及测序观察转染细胞的线粒体DNA改变的特点,并进一步通过流式细胞仪观察转染细胞凋亡情况。

实验结果:

    1.成功构建了pcDNA3.1(+)-SW480 mtDNA pcDNA3.1(+)-LoVo pcDNA3.1(+)- NHWBC(nomal human white blood cell) mtDNA 3个不同细胞株mtDNA重组表达载体。

    2.转染NIH3T3细胞及LST细胞后,经G418筛选,获得了3个不同细胞株mtDNA及空载体的稳定的4株阳性克隆转染细胞株,并进行了大量扩增。

    34NIH3T3转染细胞mtDNA D-环区分别检测到91184个突变点,并相应有3432个多态性变化。从中可见pcDNA3.1(+)-SW480 mtDNA pcDNA3.1(+)-LoVo pcDNA3.1(+)NHWBC mtDNA重组表达载体转染后的NIH3T3细胞线粒体突变数较转染空pcDNA3.1(+)的明显增多。

    4.转染前后,各组间细胞凋亡无明显变化。

    5.转染细胞的核基因组可扩增出目的基因及Neo基因。

实验结论

    1.转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点。2.通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内。3. 突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后,不影响转染细胞的凋亡。4. mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常,从而参与肿瘤的发生发展。

 
 
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