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应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌相关基因

时间:2005-10-27南方医院消化内科  作者:肖冰、叶方鹏查看次数:4415

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌相关基因

肖冰     叶方鹏

    目前研究认为:肿瘤的发生发展就细胞而言,是由于癌基因的激活与抑癌基因的失活而造成的。虽然对大肠癌发生发展过程中的基因变化已有较多的研究,但至今尚未发现与大肠癌发生发展有关的特异性基因,直接导致目前临床上对早期大肠癌诊断、治疗等各方面均缺乏有效的手段。随着近年来分子生物学技术的飞速发展,寻找大肠癌相关基因,深入了解肿瘤发生发展的分子机制已成为可能。

    目的:利用抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive hybridization SSH)构建大肠癌组织及癌旁正常粘膜之间差异表达cDNA文库,分离并克隆出大肠癌发病的相关基因,从基因分子水平探讨大肠癌的癌变机理,以期为大肠癌的早期诊断及基因治疗提供理论依据。

    方法:以大肠癌组织和正常大肠粘膜作为研究对象,分别提取组织总RNAmRNA并反转录成cDNA。以大肠癌组织cDNA作为Tester cDNA,正常粘膜cDNA作为Driver cDNA,经RsaI酶切,接头连接后进行连续两次消减杂交和两次PCR反应以获得差异表达基因片断。将PCR产物与T载体相连接并转化DH5a大肠杆菌感受态细胞,构建人大肠癌消减抑制杂交cDNA文库。从库中随机挑取200个白色菌落,使用日霜推荐毛孔how to lose ab fat排行榜左旋肉碱什么牌子好瘦腿有用吗精油减肥瘦身产品排行榜有效去痘印最有效的产品排名防晒霜排行榜品牌增高药排行榜10强毛孔防晒霜哪种好用最好面部喷雾什么牌子好PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序,将测序结果登录GeneBank进行同源性对比分析,并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。

    结果:从大肠癌组织和癌旁正常粘膜提纯了高质量的总RNAmRNA,完整反转录为cDNA后经RsaI完全酶切后,获得了长度均一性较好的短片段。高效连接特定的接头,经过连续2轮消减杂交及巢式PCR扩增,得到大肠癌相关基因消减cDNA片断,经检测消减效率较高。构建人源性大肠癌消减cDNA文库,从库中随机挑取200个白色菌落,经PCR鉴定其中176个有目的基因片断的插入。挑取其中50个阳性克隆进行测序,并将测序结果提交GeneBank进行同源性对比分析。共获得20个差异表达的基因。对其中6个基因进行Virtual Northern Blot分析,结果说明消减杂交成功,差异表达明显,可进一步作为大肠癌相关分子进行深入研究。

    结论:运用SSH技术成功的构建了大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库,共筛选出20个差异表达的的基因片断,涉及癌基因、DNA合成、细胞信号传导、能量代谢、细胞凋亡等相关的基因。其中有2个片断未检测到同源性序列,根据杂交结果考虑可能是在大肠肿瘤中差异表达的新基因。

 
 
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