摘要: 50例胃癌患者经超声内镜(EUS)行术前分期,同时取活检组织作增殖细胞核抗原(PCNA)标记、p53及 bcl-2基因蛋白表达和DNA原位未端标记(TUNEL)等检测，研究胃癌组织中细胞增殖和凋亡与胃癌进展期的关系。胃癌组织 PCNA阳性细胞标记指数为0.69±0.20，p53、bcl-2基因表达阳性率分别为52.0%和68.0%,TUNEL总标记率为13.7%。低分化胃癌TUNEL标记率明显降低，余3项指标均与胃癌的组织类型无明确关系。PCNA标记、p53基因表达与胃癌EUS TN分期呈正相关，TUNEL呈逆相关改变，而bcl-2与胃癌TN分期无明确关系。提示PCNA标记、p53基因表达及TUNEL与胃癌分期及淋巴结转移状态有明显的相关性，bcl-2基因表达不宜作为胃癌分期、预后判断的指标。细胞增殖与凋亡的异常改变可能是胃癌浸润转移的机制之一。
关键词: 胃癌 细胞增殖 细胞凋亡 基因调控
Study on the relationship of preoperative staging of gastric carcinoma by endoscopic ultrasonography with cell proliferation and apoptosis
Guo Wen, Zhang Yali, Tan Xiaohua,Sun Yong, Zhou Dianyuan
PLA Institute for Digestive Diseases,
Abstract: 50 biospy specimens of gastric carcinoma were dedected by immuno-histochemistry for the labelling of PCNA, the expression of p53 and bcl-2 genes, and by TUNEL for DNA fragrant of apoptosis .The relation of the cell proliferation and apoptosis with the stage of gastric carcinoma development was studied. The results showded: The labelling index of PCNA positive cell was 0.69±0.20, the expression rate of p53 and bcl-2 was 55.2% and 68.0%, respectively, and the labelling index of gastric carcinomas by TUNEL was 13.7±3.2. The labelling index of TUNEL reduced obviously at the lesion of poorly differentiated adenocarcinoma(p<0.05). There was an obverse relation between the labelling of PCNA or the expression of p53 gene and the EUS TN staging of gastric carcinoma, and the TUNEL labelling showed the reverse relation with TN staging. However, the expression of bcl-2 gene was not related to the invasive depth of tumor. The study suggested that the PCNA labelling, the expression of p53 gene and TUNEL had close relation to the invasive depth and the state of lymph node metastasis in gastric carcinoma, and the bcl-2 may be unsuitable for the staging and prognosis parameters.
Keywords: gastric carcinoma preoperative staging endoscopic ultrasonography
cell proliferation apoptosis
细胞凋亡(Apoptosis)是由内在基因调控的一种程序化细胞死亡(Programmed cell Death, PCD)[1]。细胞的增殖和死亡保持着动态平衡是保持组织内稳态的必要条件，而这一平衡的破环，常被认为是癌形成的重要原因[2]。在正常的胃粘膜,上皮细胞的脱落和更新,主要是由细胞的增殖与凋亡这一动态过程来完成,然而在胃癌发生与进展时,对细胞增殖与凋亡的机制所知甚少。本文试图通过对胃癌组织中增殖与凋亡有关指标的的形态学观察,以探讨胃癌发生与进展的机制。
材料与方法
一、组织标本
临床50例胃癌病人,其中男性29例,女性21例,年龄25-65岁(平均52.4岁),按超声内镜检查,进行TN分期[3]。每例内镜下活检取粘膜病变和邻近非癌变组织作石蜡包埋切片，行HE染色进行分化程度的分级。利用增殖细胞核抗原(PCNA)标记、p53基因蛋白表达检测以反映粘膜细胞增殖状态。以DNA原位未端标记和bcl-2免疫组化染色观察细胞凋亡情况。所有病例于2周内手术,作术后病理TN分期对照。
二、DNA原位未端标记(TUNEL)
按我们已报告方法进行[4], 切片用2×SSC液和0.5%胃蛋白酶处理后,滴加含
三、免疫组化染色
按过去报告方法进行[5],PCNA单抗为Dako公司产品，p53单抗为Santa Cruz产品。采用免疫组化SP法进行染色。细胞核出现明显的深棕色染色为阳性反应。PCNA标记换算成标记指数(LI)即PCNA阳性细胞数/计测的细胞核总数。
四、统计学处理
各组定时数值以均数±标准差(X±SD)表示。多组均数的显著性检验采用FLSD检验, 率的显著性检验采用x2检验。统计处理由计算机完成。
结 果
一、胃癌组织细胞增殖观察
采用SP法对增殖细胞核抗原进行免疫组化染色，阳性染色物质呈棕色细胞核着染。在癌旁胃粘膜,PCNA标记的细胞主要位于粘膜下层的2/3区域隐窝部, 多位于腺上皮的基底侧,标记指数为0.31±0.12。在胃癌病变, PCNA阳性细胞则分布于全粘膜层, 标记指为0.69±0.20，两者相比相差非常显著(P<0.01)。
p53基因蛋白表达主要为细胞核标记, 细胞核出现明显的深棕色染色为阳性反应。在癌变粘膜有26例呈阳性反应, 阳性率占52.0%, 癌旁阳性者仅4例, 阳性率为8.0%。
二、胃癌组织细胞凋亡的观察
HE染色下, 凋亡细胞散在分布于胃腺上皮层内，以细胞核固缩、碎裂为特征。采用Biotin-16-dUPT对凋亡细胞内DNA 断裂片段进行未端标记，凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，多位于腺上皮的近腔面，部分细胞浆可因核DNA碎片的逸出呈阳性着染。标记细胞除见于固缩、碎裂核外, 也见于一些无明显固缩的细胞核, 总标记指数为13.7±3.2 。非标记细胞核被苏木素复染成蓝色，核相对较大。
bcl-2基因蛋白表达主要为细胞浆或细胞膜呈棕色着染, 在11例癌灶旁粘膜, 阳性反应物质主要为弱染色, 位于胞核上区, 阳性率为22.0%。在胃癌上皮则呈全细胞型分布。染色不均匀, 强弱不一, 阳性率为68.0%(34/50)。
三、细胞增殖、凋亡与胃癌分化程度的关系
50例胃癌中，高、中、低分化腺癌分别为21、18和11例。分析PCNA、p53、bcl-2和DNA末端标记与胃癌分化程度的关系见表1. 在胃癌高、中、低分化中, 虽然PCNA标记指数有增高趋势,但无统计学差异(p>0.05)。反应细胞凋亡量的DNA末端标记指数呈降低的趋势，且高、低分化组间差异显著(p<0.05)。p53和bcl-2基因蛋白在不同分化的胃癌表达无规律性。
高分化腺癌 21 0.51±0.30 10(47.6) 14.1±3.2 14(66.7)
中分化腺癌 18 0.68±0.21 10(55.6) 11.3±1.7 13(72.2)
* 与高分化癌比, 0.025
四、细胞增殖、凋亡与胃癌浸润转移的关系
对照术后病理TN分期，术前EUS T分期的准确性为86.0%，N分期为84.0%（表2）。分析细胞增殖、 凋亡与胃癌术前分期的关系见表3, T3,T4期浆膜浸润型胃癌与T1,T2期胃癌相比, p53和PCNA标记指数明显增高(p<0.05)。有淋巴结转移组 PCNA标记比无淋巴结组高(p<0.05)。DNA末端标记与胃癌TN分期呈逆相关(
bcl-2基因蛋白产物在早期癌中有较高的表达率，达80%，但与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移无关。进一步分析胃癌细胞增殖与凋亡的的关系发现，26例p53阳性的胃癌中仅有13例bcl-2呈阳性表达(50.0%), 而p53阴性的病例bcl-2阳性表达率上升为87.5%(21/24，p<0.05)，显示p53和bcl-2的表达在胃癌中呈反向关系。DNA末端标记与PCNA及p53基因蛋白表达呈相反的趋势，与bcl-2蛋白表达间无规律可循。
病理分期 例数 EUS 分期(n) EUS诊断
T分期
T1 5 5 0 0 0 100.0
T2 8 0 7 1 0 87.5
T3 18 0 1 15 2 83.3
T4 19 0 0 3 16 84.2
总计 50 5 8 19 18 86.0
N分期
N0 21 18 3 85.7
N+ 29 5 24 82.8
T1 粘膜下 5 0.51±0.09 0( 0.0) 15.1±2.2 4(80.0)
T2 肌层 8 0.58±0.12 2(25.0) 13.2±1.9 5(62.5)
T3 浆膜 19 0.70±0.11 12(63.1)* 10.7±2.2*13(68.4)
T4 浆膜外 18 0.74±0.10* 12(66.7)* 10.1±2.3*12(66.7)
N0 无转移 23 0.52±0.19 8(34.8) 13.9±2.3 16(69.6)
l 与T1期比, 0.025
讨 论
凋亡在生物体内普遍存在，是受基因调控的一种主动死亡方式[1,2]。细胞的增殖与死亡是细胞生长分化的基本过程，在基因的调控下，通过细胞增殖过程完成组织器官的生长发育与修复，通过细胞凋亡淘汰对机体不利或“突变”的细胞群以保证正常的组织器官功能。正常情况下，细胞增殖与死亡处于一种平衡状态。业已表明，肿瘤的发生可能并非是单纯的细胞增殖异常，而是细胞增殖与死亡失平衡的结果。凋亡调控失常可导致细胞增殖失衡，被认为是肿瘤形成的机制之一。近年来的研究表明，凋亡与肿瘤的发生、发展和转归有密切的关系。
目前，研究肿瘤细胞增殖活性的方法有多种[6], 但以PCNA免疫组化最为常用, 可用于常规福尔马林固定、石蜡包埋的组织材料。业已表明, PCNA标记指数可以较精确地判定胃粘膜中增殖细胞所占的比例。本文应用PCNA免疫组化技术观察了增殖细胞标记指数与超声内镜术前分期的关系, 结果表明, PCNA标记与胃癌分期及淋巴结转移状态有明显的相关性: 胃癌病变, PCNA标记指数为0.69±0.20，这种增殖指标虽与胃癌的组织类型无明确关系, 但在不同EUS分期中, 标记指数有增高趋势, 浸润愈深，该指数愈高；淋巴结转移时, 该指标亦明显升高。
在观察凋亡的诸多方法中，形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法[7,8]。其中,原位未端标记是一种运用生化原理结合形态学特征对凋亡细胞进行检测的一种方法[4]。细胞凋亡时，其核染色体被钙镁离子依赖的内源性核酸酶从核小体间断裂成间隔180-200bp的核苷酸链，断链产生一粘性未端，一条含有游离的3'羟基末端，另一条有伸出的5'末端。利用klenow片段的5'-3'聚合酶活性，可将外源带有生物素标记的游离核苷酸从3'羟基末端起始经5'-3'方向连接在断端上，通过带有辣根过氧化物酶的卵白素与之结合，经DAB显色，便可观察到细胞是否存在有核苷酸掺入的DNA断端。本文采用Biotin-16-dUPT对胃癌凋亡细胞内DNA 断裂片段进行未端标记， 总标记指数为13.7±3.2。该标记指数与胃癌的组织学类型有关，低分化腺癌标记率较高分化癌明显降低(p<0.05)。分析不同EUS分期的DNA末端标记指数，显示该指标与肿瘤浸润深度和淋巴结转移呈逆相关(p<0.05)。
调控胃肠上皮细胞增殖和凋亡的机制很复杂，可能与多种原癌基因和抗癌基因有关, 其中以bcl-2和p53基因最为重要[9-11]。业已表明, bcl-2是对细胞凋亡起抑制作用的基因，虽然其调控程序性细胞死亡的机理仍不明了，但有证据表明bcl-2主要是与其他蛋白如Bax形成杂二聚体后发挥其生理功能。bcl-2还可以与其它癌基因如c-myc和抗癌基因p53相互作用，间接地调控程序性细胞死亡。文献表明胃粘膜上皮发生不典型增生或出现萎缩性胃炎时, 可出现异常的bcl-2的表达, 使得粘膜细胞能逃避正常的凋亡机制而易于发生癌变。本研究结果显示：bcl-2基因蛋白表达主要为细胞浆或细胞膜着染, 在胃癌癌灶旁粘膜有22.0%阳性表达率，而于癌灶上皮阳性率上升为68.0%。bcl-2产物在T1期癌中的阳性表达最高, 提示bcl-2的表达是胃癌形成过程中的早期事件。一些文献报告, bcl-2高表达见于分化较好的胃肠肿瘤, 但本文并未发现bcl-2基因表达与胃癌分化程度及胃癌浸润深度和淋巴结转移状态有关，提示bcl-2基因蛋白表达并不能作为胃癌分期、预后判断的独立的指标。
p53的生物学功能极为复杂，近年的研究表明，p53蛋白起着"分子警察"的作用，对DNA的复制起监视作用。当DNA在复制中发生DNA损伤时，p53可使细胞周期在从G1向S期过渡时阻滞在S期，给予充分的时间有利于DNA损伤的修复，如果修复成功，则继续细胞周期的循环，否则，p53则启动细胞凋亡机制，导致DNA受损的细胞死亡，以防细胞发生突变而恶性转化。本研究采用SP法，对胃癌术前活检组织进行免疫组化染色，其p53蛋白产物的阳性率为52%，这种表达与凋亡标记指数呈相反的趋势，在肿瘤浸润至浆膜层后或有淋巴结转移时明显增高，但与胃癌的组织类型无相关性。提示：p53在胃癌的形成中属较晚期的分子事件以及正常p53功能的缺失与胃癌中细胞凋亡调控异常关联。进一步分析胃癌中p53和bcl-2表达情况发现，二者呈反向关系。提示胃癌中bcl-2的表达被突变的p53下调了。这一作用的潜在性分子基础可能是bcl-2基因中含有p53依赖的负性反应元件，通过该元件的p53可直接或间接地在转录水平上下调bcl-2的表达。bcl-2的过度表达，使胃癌生存期延长，为其它基因(如p53、APC、ras、DCC等)的改变提供机会。而这些基因反过来又参与胃癌凋亡的调控，加强bcl-2对凋亡抑制作用。
综上所述，胃癌的浸润转移与癌细胞的增殖性相一致，与癌细胞的凋亡相逆，术前EUS分期能够反映胃癌的这一生物学特性。PCNA染色、p53基因表达及ISEL检测均能反映出胃癌细胞的恶性度、侵袭性及转移性等生物学行为，可作为判断胃癌进展与预后的重要指标。同时可见，癌形成过程中细胞增殖与凋亡的机制很复杂，对这一机制的深入研究和进一步阐明，无疑对胃癌发生发展机理提供可靠的生物学基础，同时也可为其治疗策略提供一条新的靶点。
参考文献
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3. Tio TK. The TNM staging system. Gastrointest Endosc,1996,48(2):s19.
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5. 张亚历,周殿元,彭华生等.大肠肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)表达与AgNOR计数的对比研究.中国肿瘤临床 1995;22(2):119
6. Editorial.Clinical application of morphological and immunocytochemical assessments of cell proliferation.Am J Clin Path 1992；97(5 supplI):S4
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