【摘要】 目的 探讨细胞增殖与细胞凋亡标记与胃癌浸润程度的相关性。方法 外科手术切除的50例胃癌均病理对浸润深度进行确认。病变粘膜用增殖细胞核抗原(PCNA)标记和DNA原位末端标记(TUNEL)进行检测．结果 胃癌组织 PCNA阳性细胞标记指数为0.69±0.20, TUNEL标记指数为13.7±3.2。低分化胃癌TUNEL标记指数明显降低。PCNA标记与胃癌浸润程度呈正相关，TUNEL呈逆相关改变。结论 PCNA及TUNEL标记与胃癌浸润程度及淋巴结转移状态有明显的相关性，细胞增殖与凋亡的异常改变可能是胃癌浸润转移的机制之一。

    【关键词】 胃癌  细胞增殖  细胞凋亡

Study on the relationship of the invasion of gastric carcinoma with cell proliferation and apoptosisGuo Wen, Zhang Yali, Tan Xiaohua,et al. PLA Institute for Digestive Diseases, NanfangHospital, First Medical University of PLA, Guangzhou,510515

    【Abstract】 Obiective To study the relation of the cell proliferation and apoptosis with the invasion of gastric carcinoma. Method 50 surgical specimens of gastric carcinoma were were identified by histopathology and dedected by immuno-histochemistry for the labelling of PCNA and by TUNEL for DNA fragrant of apoptosis .Result The labelling index of PCNA positive cell was 0.69±0.20, and the labelling index of gastric carcinomas by TUNEL was 13.7±3.2. The labelling index of TUNEL reduced obviously at the lesion of poorly differentiated adenocarcinoma(p<0.05). There was an obverse relation between the labelling of PCNA and the invasive depth of gastric carcinoma, and the TUNEL labelling showed the reverse relation with invasive staging. Conclusion The study suggested that the PCNA labelling and TUNEL had close relation to the invasive depth and the state of lymph node metastasis in gastric carcinoma.

    【Key words】gastric carcinoma  cell proliferation  apoptosis

    细胞凋亡(Apoptosis)是由内在基因调控的一种程序化细胞死亡(Programmed cell Death, PCD)^[1]。细胞的增殖和死亡保持着动态平衡是保持组织内稳态的必要条件，而这一平衡的破环，常被认为是癌形成的重要原因^[2]。在正常的胃粘膜,上皮细胞的脱落和更新,主要是由细胞的增殖与凋亡这一动态过程来完成,然而在胃癌发生与进展时,对细胞增殖与凋亡的机制所知甚少。本文试图通过对胃癌组织中增殖与凋亡有关指标的的形态学观察,以探讨胃癌发生与进展的机制。

材料与方法

一、组织标本

    外科切除的胃癌病例共50例。术后均经病理检查证实并按浸润深度分期。其中男性29例,女性21例,年龄25-65岁(平均52.4岁)。每例均于病变和邻近非癌变组织取材作石蜡包埋切片，行HE染色进行分化程度的分级。利用增殖细胞核抗原(PCNA)标记检测细胞增殖状态。以DNA原位末端标记检测细胞凋亡情况。

二、DNA原位末端标记(TUNEL)

    按已报告方法进行^[3], 切片用2×SSC液和0.5%胃蛋白酶处理后,滴加含0.005mM dNTP(dATP,dCTP,dGTP),0.005mM biotin-16-dUTP和25U/ml Klenow大片段的标记液50μl，湿盒内25℃温育1小时。滴加HRP-avidn, 再经DAB-H₂O₂显色。观察计测腺上皮中阳性细胞数, 换算成标记指数(LI)即阳性细胞数/计测的细胞核总数。阴性对照片加不含Klenow的标记液。

三、免疫组化染色

    按已报告方法进行^[4],PCNA单抗为Dako公司产品。采用免疫组化SP法进行染色。细胞核出现明显的深棕色染色为阳性反应。

四、统计学处理

    各组数值以均数±标准差(X±SD)表示。多组均数的显著性检验采用FLSD检验，统计处理由计算机完成。

结  果

一、胃癌组织细胞增殖观察

    采用SP法对增殖细胞核抗原进行免疫组化染色，阳性染色物质呈棕色细胞核着染。在癌旁胃粘膜,PCNA标记的细胞主要位于粘膜层的下2/3区域隐窝部, 多位于腺上皮的基底侧,标记指数为0.31±0.12。在胃癌病变, PCNA阳性细胞则分布于全粘膜层, 标记指数为0.69±0.20，两者相比相差非常显著(P<0.01)。

二、胃癌组织细胞凋亡的观察

    HE染色下, 凋亡细胞散在分布于胃腺上皮层内，以细胞核固缩、碎裂为特征。采用Biotin-16-dUPT对凋亡细胞内DNA 断裂片段进行末端标记，凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，多位于腺上皮的近腔面，部分细胞浆可因核DNA碎片的逸出呈阳性着染。标记细胞除见于固缩、碎裂核外, 也见于一些无明显固缩的细胞核, 总标记指数为13.7±3.2 。非标记细胞核被苏木素复染成蓝色，核相对较大。

三、细胞增殖、凋亡与胃癌分化程度的关系

    50例胃癌中，高、中、低分化腺癌分别为21、18和11例。分析PCNA和DNA末端标记与胃癌分化程度的关系见表1. 在胃癌高、中、低分化中, 虽然PCNA标记指数有增高趋势,但无统计学差异(p>0.05)。反应细胞凋亡量的DNA末端标记指数呈降低的趋势，且高、低分化组间差异显著(p<0.05)。

         表1.细胞增殖、凋亡与胃癌分化程度的关系

    分化程度  例数    PCNA标记       TUNEL标记

   高分化腺癌  21    0.51±0.30      14.1±3.2

   中分化腺癌  18    0.68±0.21      11.3±1.7 

   低分化腺癌  11    0.71±0.27       9.7±2.2*

     * 与高分化癌比, 0.025

四、细胞增殖、凋亡与胃癌浸润转移的关系

    分析细胞增殖、 凋亡与胃癌浸润程度的关系见表2,浆膜浸润型胃癌与粘膜下及肌层浸润癌相比, PCNA标记指数明显增高(p<0.05)。有淋巴结转移组 PCNA标记比无淋巴结组高(p<0.05)。DNA末端标记与胃癌浸润深度呈逆相关(p<0.05)。

    表2. 细胞增殖、凋亡与EUS术前评价胃癌浸润转移的关系

   浸润深度与淋巴结转移  例数   PCNA标记      TUNEL标记

    粘膜下浸润             5    0.51±0.09      15.1±2.2

    肌层浸润               8    0.58±0.12      13.2±1.9

    浆膜浸润              18    0.69±0.13      10.2±2.0*

    浆膜外浸润            19    0.77±0.14*     10.4±2.5*

    无转移                21    0.53±0.18      14.1±2.4

    有转移                29    0.79±0.29**     8.9±3.3**

*与粘膜下癌比较0.025

讨  论

    目前，研究肿瘤细胞增殖活性的方法有多种, 但以PCNA免疫组化最为常用^[5]。业已表明, PCNA标记指数可以较精确地判定胃粘膜中增殖细胞所占的比例。本研究应用PCNA免疫组化技术观察了增殖细胞标记指数与胃癌浸润的关系, 结果表明, PCNA标记与胃癌浸润程度及淋巴结转移状态有明显的相关性: 胃癌病变, PCNA标记指数为0.69±0.20，这种增殖指标虽与胃癌的组织类型无明确关系, 但随浸润加深, 标记指数有增高趋势, 浸润愈深，该指数愈高； 淋巴结转移时, 该指标亦明显升高。

    在观察凋亡的诸多方法中，形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法^[6]。其中,原位末端标记是一种运用生化原理结合形态学特征对凋亡细胞进行检测的一种方法。细胞凋亡时，其核染色体被钙镁离子依赖的内源性核酸酶从核小体间断裂成间隔180-200bp的核苷酸链，断链产生一粘性末端，一条含有游离的3'羟基末端，另一条有伸出的5'末端。利用klenow片段的5'-3'聚合酶活性，可将外源带有生物素标记的游离核苷酸从3'羟基末端起始经5'-3'方向连接在断端上，通过带有辣根过氧化物酶的卵白素与之结合，经DAB显色，便可观察到细胞是否存在有核苷酸掺入的DNA断端。该研究采用Biotin-16-dUPT对胃癌凋亡细胞内DNA 断裂片段进行末端标记， 总标记指数为13.7±3.2。该标记指数与胃癌的组织学类型有关，低分化腺癌标记率较高分化癌明显降低(p<0.05)。分析胃癌浸润程度与DNA末端标记指数的关系，显示该指标与肿瘤浸润深度和淋巴结转移呈逆相关(p<0.05)。  

胃癌的浸润转移与癌细胞的增殖性相一致，与癌细胞的凋亡相逆，增殖细胞核抗原与细胞凋亡原位末端标记均能够反映胃癌的这一生物学特性。用于胃癌的研究可反映出胃癌细胞的恶性度、侵袭性及转移性等生物学行为，因此,可作为判断胃癌进展与预后的重要指标。

参考文献

1.         Kerr JFR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide~ranging implicatrons in tissue kinetics. Br J Cancer  1972; 26:239~257.

2.         谭晓华,张亚历,姜泊.癌症治疗的新靶点:程序化细胞死亡的基因调控.现代消化病及内镜杂志.1996;1:12~13.

3.         谭晓华,张亚历,姜泊.常规组织切片凋亡细胞原位末端标记法.细胞生物学杂志 1997;(10):57~59.

4.         张亚历,周殿元,彭华生等.大肠肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)表达与AgNOR计数的对比研究.中国肿瘤临床 1995;22(2):119~120.

5.         Editorial.Clinical application of morphological and immunocytochemical assessments of cell proliferation.Am J Clin Path 1992;97(5 supplI):S4~S11.

6.         张亚历,姜泊.编程性细胞死亡及研究方法.细胞生物学杂志 1995;17:127-129.