摘要: 应用a胰蛋白酶单抗特异性地识别组织间质中的肥大细胞，DNA原位末端标记计测腺上皮中的凋亡细胞数，同时比较p53阳性表达与肥大细胞的关系。结果表明, 胃癌分化程度与癌间质肥大细胞(MC)计数无显著性差异，但T3、T4期癌及出现淋巴结癌转移者，MC计数明显低于T1和T2期或无转移组(p<0.05)。研究其与细胞凋亡指数的关系表明，MC高计组凋亡指数为13.1±2.2，低计组为7.4±2.4，两组间有显著差异(p<0.05)，但p53表达率在两组间相差无显著性。ＭＣ与凋亡指数的正相关性，提示ＭＣ的增多可能与诱导癌细胞凋亡有关。

    关键词:  胃癌 细胞凋亡 肥大细胞

Study on the mucosal mast cell counting and its relation to

cell apoptosis in gastric carcinoma

Guo Wen, Zhang Yali, Tan Xiaohua, Xu Keqiang, Zhou Dianyuan

PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital,

First Medical University of PLA, Guangzhou,510515

     Abstract: By using the monoclonal antibody of α-trypsinase to identify specifically mast cells (MC) in mucosa mesenchyma, the relationship of MC with cell apoptosis and infiltration in gastric carcinoma was studied. The results showed the number of mast cells had no obvious difference among the differentiational degree of cancer cell, but the count  in T3 ~ T4 or lymph node metastasis was lower in T1 ~ T2 or no metastasis (p<0.05). Compared with the lower-count mast cell group, the cases with higher-count group showed higher the number of apoptotic cells (13.1±2.2 to 7.4±2.4, p<0.05). This obverse relation indicated that the increase of MC bore a relationship to the increase of apoptotic cells, and the later could reduce the infiltration and metastasis of cancer cell.

    Keywords: Mast cell  Apoptosis  Gastric carcinoma

    胃肠肿瘤浸润转移过程中，常可见到癌间质中有多量肥大细胞(Mast cell,MC)的存在, 说明MC与肿瘤的发生发展有一定的关系, 但在胃癌中的作用机制尚不十分清楚。考虑到MC具有抵抗肿瘤生长的作用，而细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡方式，可由多种外界因素诱导和内在基因调控，因此有必要探讨胃癌细胞凋亡与间质MC的关系。本文应用a胰蛋白酶单抗特异性地识别组织间质中的MC、DNA原位末端标记(TUNEL)计测腺上皮中的凋亡细胞数，同时比较p53阳性表达与MC的关系。

1  材料与方法

1.1  组织标本：50例胃癌手术切除病人，进行TN病理分期，取癌组织作石蜡包埋切片，行HE染色作分化程度的分级。其中高分化腺癌21例、中分化腺癌18例、低分化腺癌11例。TN分期为：T1期5例、T2期18例、T3期14例、T4期13例，伴淋巴结转移19例、无淋巴结转移31例。

1.2  MC免疫组化染色：应用a胰蛋白酶单抗（英国Southampton大学AF Walls博士提供）特异性地识别组织间质中的MC，采用免疫组化SP法^[1]进行染色：切片脱蜡复水化，用0.3%H₂O₂甲醇液阻断内源酶。1:100 的正常马血清滴片以减少非特异性着色。然后滴加a胰蛋白酶单抗(1:100)，于湿盒内置4℃ 冰箱过夜，然后滴加1:200生物素标记的二抗45分钟，洗后滴加Avidin-HRP试剂(1:200稀释)，经0.1%DAB-H₂O₂ 显色后，苏木素衬染、常规脱水透明、封片。计测时，在胃癌组织MC集中区域随机计数10个高倍视野，求其均数。

    p53单抗为Santa Cruz产品，染色方法同上。

1.3  DNA原位未端标记：采用Biotin-16-dUPT对凋亡细胞内DNA 断裂片段进行未端标记^[2]：切片脱蜡复水化, 浸入2×SSC液中(80℃，20分钟)，蒸镏水冲尽。用0.5%胃蛋白酶(pH2.0)37℃消化10分钟，水洗后用滤纸拭干切片周边液体，滴加含0.005mM dNTP(dATP,dCTP,dGTP)、0.005mM biotin-16-dUTP和25U/ml Klenow大片段的标记液50μl，湿盒内25℃温育1小时。PBS漂洗后，阻断内源酶、滴加HRP-avidn复盖组织，室温下30分钟。DAB-H₂O₂显色、苏木素复染、常规脱水透明、封片。阴性对照片加不含Klenow的标记液，余同。观察时，计测腺上皮中阳性细胞标记指数，即阳性细胞数/计测的细胞核总数。

1.4  统计学处理：MC计数、凋亡指数以均数，p53表达率以百分率表示，分别采用t和x²检验进行显著性比较。

2  结果

2.1  胃癌组织间质MC的观察：MC阳性染色物质呈棕色细胞膜或胞浆着染，MC散在分布于粘膜腺体之间或紧贴腺上皮基底膜外。高分化腺癌间质MC计数为19.4±2.32, 中、低分化癌分别为17.7±1.94和17.2±2.12，各组之间无显著性差异(p<0.05)。比较胃癌分期与MC计数的关系，T3、T4期癌间质MC计数分别为11.3±2.21和13.4±1.98, 明显低于T1(21.2±2.41)和T2(18.2±1.97)期(p<0.05)。比较有无淋巴结转移的病例, 19例转移病例MC计数为10.8±2.31，而无转移的31例为19.8±2.34(p<0.01)。

2.2  胃癌细胞凋亡与间质MC关系的观察：凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，多位于腺上皮的近腔面，总标记指数为13.7±3.2。将MC计数³20分为高计组(19例), <20作为低计组(31例), 比较其与细胞凋亡指数的关系，高计组凋亡指数为13.1±2.2，低计组为7.4±2.4，两组间有显著差异(p<0.05)。

2.3  p53基因表达与胃癌间质MC关系的观察：p53基因蛋白表达主要为棕红色细胞核标记，阳性率为40.0%(20/50)。研究p53基因表达与MC关系表明：MC高计组，p53表达率为42.1%(8/19), 低计组为38.7%(12/31)，两组相比相差无显著性(p>0.05)。

3  讨论

    MC与肿瘤的关系长期以来为人们所关注，但研究结果并不完全一致。虽有作者认为MC愈多，预后就愈差，与预后间呈现一种负相关^[3]。但多数研究表明MC与肿瘤预后间存在正相关关系，肿瘤中的ＭＣ愈多，患者生存时间越长，预后也愈好。指出ＭＣ有对抗肿瘤、保护宿主的作用。其机理可能与ＭＣ直接释放肝素、组胺等生物活性物质，对肿瘤有直接的细胞毒作用^[4]。

    本文首次采用SP法对MC进行免疫组化染色，可特异显示胃癌间质中的MC。观察表明，ＭＣ计数与胃癌细胞组织分化程度并无明显的相关性。比较胃癌分期与MC计数的关系，则显示T3、T4期癌MC计数明显低于T1和T2期癌，有淋巴结转移病例，MC计数低于无转移的病例，提示ＭＣ可能与肿瘤的进展情况有关。

    细胞凋亡与癌细胞的存活有密切关系，其凋亡过程可由多种因子所诱导^[5]。MC可释放多种细胞生物因子，因此与细胞凋亡可能存在一定的相关性。有关MC与细胞凋亡的关系目前并无文献报道。本文采用Biotin-16-dUPT对凋亡细胞内DNA 断裂片段进行末端标记，标记率为13.7±3.2。比较ＭＣ计数与细胞凋亡指数的关系表明，ＭＣ高计组凋亡指数较低计组为高，这种正相关性提示ＭＣ的增多可能与凋亡细胞的增多有关，而后者可减少癌细胞的浸润转移。p53基因与癌浸润转移及细胞凋亡有复杂的基因调控机制。本文研究表明，胃癌中p53基因蛋白表达阳性率为40.0%, 探讨其与胃癌间质MC关系表明，MC高计组p53表达率与低计组相比相差无显著性，提示ＭＣ的计数与p53基因表达间可能无明显的相关性。

    从本文结果看，胃粘膜间质MC与胃癌分期有一定的联系，MC计数的增加与胃癌的浸润转移呈负相关，其对癌进展的抵抗作用可能与增加的细胞凋亡有关。目前，文献研究中MC与胃癌关系结论不一的情况，可能与选用的MC染色与计测方法不同有关。MC单抗的特异性识别为MC计数的统一和规范化提供了基础。值得注意的是，胃癌的发生发展是一种十分复杂的过程，由于MC的类型不同、胞浆颗粒中的成份不同，其释放物质所起的作用不同。因此，对于取材不同的胃癌组织,也是引起MC结果差异的重要原因。

 参考文献

1.         张亚历,周殿元,彭华生等.大肠肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)表达与AgNOR计数的对比研究.中国肿瘤临床 1995;22(2):119

2.         谭晓华,张亚历,姜泊.常规组织切片凋亡细胞原位末端标记法.细胞生物学杂志 1997;(10):57

3.         Flsher Er, Paik Sm, Rockette H,et al.Prognostic significance of eosinophils and mast cells in rectal cancer. Hum Pathol 1989;20:159

4.         吴天鹏.组织胺对小鼠Lewis肺癌生长和转移抑制作用的病理学研究.湖北医科大学学报 1994;15:206

5.         谭晓华,张亚历,姜泊.癌症治疗的新靶点:程序化细胞死亡的基因调控.现代消化病及内镜杂志.1996;1:12~13