微小卫星是散布于整个基因组内的DNA简单重复序列,虽然在个体之间存在明显的差异,但在遗传学上具有高度的保守性, 突变率极低[1]。近年来国外的研究资料显示，微小卫星DNA不稳定性(Microsatellite instability,MIN)与肿瘤及一些癌前病变密切相关[2~7], 因此, 检测MIN在临床上有重要意义。自从1995年Schlegel等报道了非同位素聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)为基础的MIN检测方法以来[8],近两年该法已用于多种临床肿瘤的检测,国内尚无这方面的研究报告。本文以胃癌MIN检测为例，重点介绍PCR单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphisms,SSCP)检测MIN方法。
材料与方法
一、组织标本
取外科切除、石蜡包埋、经组织病理学确诊的胃癌组织标本30例, 其中高、中分化腺癌12例,低分化腺癌18例。同时取每例病人的正常切缘粘膜组织作为对照。
二、主要试剂和仪器
试剂主要有: 蛋白酶K、dNTP、Tag酶购自Sangon(加拿大)公司, N,N,N,,N-四甲基乙二胺(TEMED)为SIGMA产品, 丙烯酰胺、N,N’-亚甲双丙烯酰胺为国产分析纯。所用的主要仪器为Hema 480 PCR扩增仪, Multiphor II型多用电泳系统(Pharmacia)。
三、组织消化
1. 取5μm石蜡组织切片3-6片于洁净的载玻片上;
2. 切片60℃烘烤化蜡30min后, 浸泡于盛有二甲苯的竖式缸中分别脱
蜡2次, 各5min;
3. 依次置在无水乙醇中浸泡3次, 各2-3min;
4. 取出晾干后，用保安刀片将组织刮入1.5ml Eppendorf管中，注意
刮入肿瘤组织时，先于显微镜下定位,去除出血、坏死和非瘤组织;
5. 加入50mmol/L Tris(pH8.0)-蛋白酶K(200μg/ml)消化液100μl, 短暂
离心后，37℃温育过夜;
6. 煮沸8min, 10000rpm离心10min, 取上清，置-30℃保存。
四、PCR扩增
选用四种热点部位的微小卫星DNA标志进行检测，包括第2号染色体2个标记位点(D2S123和D2S119),第5号和17号染色体各1 个标记位点(分别为D5S107和D17S250)。引物参照文献设计[1]，由加拿大真达基因公司协助合成,其序列如下:
D2S123①5,-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3' 扩增片段为197-227bp
②5'-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3'
D5S107①5'-GATCCACTTTAACCCAAATAC-3' 扩增片段为133-155bp
②5'-GGCATCAACTTGAACAGCAT-3'
D17S250①5'-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3'扩增片段为53-169bp
②5'-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3'
D2S119①5'-CTTGGGGAACAGAGGTCATT-3'扩增片段为214-232bp
②5'-GAGAATCCCTCAATTTCTTTGGA-3'
扩增时取0.5ml无菌离心管，反应体积为25μl。按下列次序加样:
无菌水10.5μl, 10×扩增缓冲剂2.5μl, 4种dNTP混合物(10mmol/L) 1μl, 引物I、 II(100 ng /ul)各2μl, 模板DNA 4μl。用25μl无菌石腊油覆盖于反应混合液之上。于97℃加热8min使DNA完全变性。将3μl Taq酶(0.75u)加入处于80℃的反应混合液中。按下面循环参数进行PCR扩增：94℃ 变性反应45秒, 55℃ 退火反应1分钟, 2℃ 延伸反应1分钟。依次进行35个循环, 72℃延伸5分钟。反应结束后，置4℃保存，并进一步分析。
五、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
用2%的琼脂糖倒胶(含溴化乙锭终浓度为0.5μg/ml), 凝胶凝固后，加入0.5×TBE电泳缓冲液，将10μl PCR扩张产物与1μl上样缓冲液(0.25%溴酚蓝-40%蔗糖水溶液)混匀依次加样。100V恒压电泳10min。在透射紫外灯下观察结果，阳性标本用于SSCP分析。
六、SSCP分析
取上述PCR产物6μl加入18μl测序加样缓冲液混匀于97℃变性8min, 置40%乙醇碎冰中冰浴5min, 再快速加样于预冷4℃的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板上。加样缓冲液含98%去离子甲酰胺、10mmol/L EDTA,pH 8.0、0.025%二甲苯青(xylene cyanole FF)、0.025%溴酚蓝。聚丙烯酰胺凝胶含5%甘油，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺(methylene bisacrylamide)为19:1。双链对照标本是将6μl PCR产物加入2μl上样缓冲液(0.25%溴酚蓝-40%蔗糖水溶液)中混匀,不作变性处理, 直接上样。13℃，400V恒压电泳4小时。电泳缓冲液为0.5×TBE。
七、银染
取下凝胶，置大玻璃平皿中, 10%乙醇固定10min, 再用1%硝酸脱色3min, 经蒸馏水漂洗3次后, 用0.012 mol/L硝酸银液染色20min, 蒸馏水漂洗3次, 0.28mol/L碳酸钠-0.019%福尔马林显影10min, 直至样本信号足够强而背景不致过高为止。蒸馏水漂洗3次后, 10%乙醇固定，定影，干胶、照像(干胶作为底片，使相纸曝光成像)。
结 果
应用银染PCR-SSCP方法检测胃癌微小卫星DNA不稳定性, 可清楚显示肿瘤细胞的MIN。若肿瘤组织中DNA重复序列有增多或减少(即表现不稳定性)，可致DNA单链的二级结构发生变化，在非变性胶电泳时, 其泳动速度会发生改变，与正常组织相应的PCR产物比较，即可出现异常的泳动带(如图版1~4)。
本文所用的4对引物, 分别代表了第2、5、17号染色体不同位点, 在所检测的30例胃癌中,11例出现1个或多个染色体位点的不稳定性, 检出率为36.7%。其中, 1例全部位点均有异常(3%), 2例有3个位点的异常(6%), 5例有2个位点的异常(16.7%), 3例只出现1个位点的异常(10%)。
分析染色体位点MIN的发生率与胃癌的关系表明, 以D5S107发生率最高,为10/30(33.3%), 其次是D2S123为9/30(30%)、D17S250为5/30 (16.7%)、D2S119为4/30(12%)。
讨 论
微小卫星DNA是真核基因组中大量而随机出现的简单重复序列, 在人类基因组中, 它们主要是由1~6个核苷酸形成的重复序列, 并以二核苷酸的重复序列(CA)n最为常见[1]。这种重复单位串联排列而成的单一序列,可用PCR体外扩增。由于其重复单位数量的改变可引起相当高的多态性，因而个体间的差异很大，但在家系中可稳定地遗传，突变率极低。微小卫星DNA不稳定性主要表现为DNA简单重复序列改变, 导致微小卫星DNA序列长度的异常。与常见的癌基因与抑癌基因改变不同, MIN主要表现为(CA)n重复次数的增多或减少。据称MIN与细胞癌变密切相关, 因此,近年来MIN被认为是细胞癌变的新机制[1~3]。
MIN的检测起初多用同位素标记PCR反应引物或反应底物(dNTP中的一种)，变性胶电泳、放射自显影后进行观察，因此设备条件要求较高, 由于受诸多的限制如同位素对环境的污染、半衰期以及国内订货日期等，使其应用受到一定的限制。本文采用银染PCR-SSCP方法, 其基础是肿瘤细胞微小卫星DNA内(CA)n或(AT)n重复序列改变, 即可导致其二级结构发生变化, 与自身正常组织的同种微小卫星DNA标记对照, 即可出现单链带的泳动变位。该法简便易行，无需序列分析仪等特殊设备, 普通实验室即可开展, 同时避免了同位素的污染及时间限制。加之硝酸银染色显示核酸的敏感性是溴化乙锭染色的200倍，其敏感性足以显示pg水平核酸的改变，因此越来越广泛应用于核酸的检测[9]。
近年来国外的研究资料显示，MIN与具有遗传背景的大肠癌有密切关系[2]。目前已将其作为大肠癌高危人群的基因筛检手段。临床上，胃癌多以肠型胃癌为主，从组织起源和发生上与大肠癌具有相同的基因改变背景，因此, 研究胃癌与微小卫星DNA不稳定性关系对阐明胃癌发生机制及提供临床诊断途径有重要意义[7]。
本文首次采用银染PCR-SSCP方法检测胃癌组织标本MIN, 发现在胃癌发生的早期可检出MIN, 其MIN的检出率与胃癌分期无明显相关性, 说明MIN是胃癌发生的早期事件, 可能是胃癌发生的重要机制。由于本文采用的MIN检测是基于石蜡包埋组织切片之上, 标本可用存档的病理蜡块, 来源丰富, 无需新鲜取材。加之所需切片组织量极少, 因此具有很好的临床推广价值, 特别适合于胃癌的临床回顾性资料研究。
摘 要
应用银染PCR-SSCP方法检测30例常规石蜡包埋胃癌组织第2、5、17号染色体4个位点的微小卫星DNA不稳定性(MIN)。结果发现11例阳性病例(36.7%), 其中出现4、3、2个及单个位点异常分别为1(3%)、2(6%)、5(16.7%)和3例(10%)。4个位点中，以D5S107发生率最高(33.3%), 其次为D2S123 (30%)、D17S250(16.7%)、D2S119 (12%)。提示MIN是胃癌病变中常见的分子遗传学事件，MIN的出现可能是胃癌发生的又一重要机制。银染PCR-SSCP是一简便、快速、灵敏、有效的检测MIN的方法。
关键词: 胃肿瘤 微小卫星DNA不稳定性 聚合酶链反应
参考文献
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DETECTION OF MICROSATELLITE INSTABILITY BY SILVER STAINING PCR-SSCP IN HUMAN GASTRIC CARCINOMA
GUO Wen ZHANG Ya Li QOU Hong Ming et al. PLA Research Institute for Digestive Diseases,
ABSTRACT
Silver staining PCR-SSCP method was used to detect microsatellite instability (MIN) at 4 loci on chromosome 2、5、17 in paraffin-embedded gastric carcinoma tissues. The abnormal shifting of the single-stranded DNA was identified in 11 out of 30 cases(36.7%). Of these 11 tumors, 1 (3%) showed MIN at all 4 loci, 2 tumors (6%) at 3 loci, 5 tumors (16.7%) at 2 loci, and 3 tumors (10%) at one locus. From these 4 loci, the detective rate of MIN was the hightest at D5S107 (33.3%), and it was 30%, 16.7%, 12% at D2S123, D17S250 and D2S119，respectively. The results indicate that MIN is a common molecular hereditary event in gastric carcinoma, and it may be one of the important mechanisms of gastric carcinogenesis . Silver staining PCR-SSCP is a convenient, rapid ,sensitive and reliable method for detecting of MIN in gastric carcinoma.
Key words: Gastric neoplasm Microsatellite instability Polymerase chain reaction